Προϊόντα

Η ανάλυση των γεγονότων φωσφορυλίωσης σε επίπεδο πρωτεώματος εξακολουθεί να είναι μια σημαντική αναλυτική πρόκληση λόγω της τεράστιας πολυπλοκότητας των δικτύων φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών.Σε αυτή την εργασία, αξιολογούμε τη συμπληρωματικότητα των Lys-N, Lys-C και θρυψίνης σε σχέση με την ικανότητά τους να συνεισφέρουν στη συνολική ανάλυση του φωσφοπρωτεώματος.Μια εξευγενισμένη εκδοχή της ανταλλαγής κατιόντων ισχυρού χαμηλού pH χρησιμοποιήθηκε για τον αποτελεσματικό διαχωρισμό των Ν-τελικά ακετυλιωμένων, φωσφορυλιωμένων και μη τροποποιημένων πεπτιδίων.Συνολικά 5036 μη πλεονάζοντα φωσφοπεπτίδια θα μπορούσαν να ταυτοποιηθούν με λανθασμένο ποσοστό ανακάλυψης <1% από 1 mg πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας συνδυασμό των τριών ενζύμων.Τα δεδομένα μας αποκάλυψαν ότι η επικάλυψη μεταξύ των συνόλων δεδομένων φωσφοπεπτιδίου που δημιουργήθηκαν με διαφορετικές πρωτεάσες ήταν οριακή, ενώ η επικάλυψη μεταξύ δύο συνόλων θρυπτικών δεδομένων που δημιουργήθηκαν παρόμοια βρέθηκε να είναι τουλάχιστον 4 φορές υψηλότερη.Με αυτόν τον τρόπο, η παράλληλη χρήση του Lys-N και της θρυψίνης επέτρεψε μια αύξηση 72% στον αριθμό των ανιχνευθέντων φωσφοπεπτιδίων σε σύγκριση με τη θρυψίνη μόνο, ενώ ένα πείραμα αντιγραφής θρυψίνης οδήγησε σε αύξηση μόνο 25%.Έτσι, όταν εστιάζουμε αποκλειστικά στα δεδομένα θρυψίνης και Lys-N, εντοπίσαμε 4671 μη περιττά φωσφοπεπτίδια.Περαιτέρω ανάλυση των ανιχνευόμενων θέσεων έδειξε ότι τα σύνολα δεδομένων Lys-N και θρυψίνης εμπλουτίστηκαν σε σημαντικά διαφορετικά μοτίβα φωσφορυλίωσης, αποδεικνύοντας περαιτέρω ότι οι προσεγγίσεις πολλαπλών πρωτεασών είναι πολύ πολύτιμες στις αναλύσεις φωσφοπρωτεοσωμάτων.