Προϊόντα

Για να ποσοτικοποιήσουμε συγκεκριμένα αρκετούς μεταβολίτες της 5-φθοροουρακίλης (5-FU) και δύο ενδογενών μονοφωσφορικών νουκλεοτιδίων, αναπτύξαμε μια πρωτότυπη μέθοδο που βασίζεται σε μια υγρή χρωματογραφία-διαδοχική φασματομετρία μάζας (LC-MS/MS).Αυτή η ανάλυση επέτρεψε τον προσδιορισμό: (i) της ενδοκυτταρικής παραγωγής 5-φθορο-2'-δεοξυουριδινο-5'-μονοφωσφορικού (5-FdUMP) από 5-FU ή 5-φθορο-2'-δεοξυουριδίνη (5-FdUrd) , (ii) την επίδραση της συγκέντρωσης 5-FdUMP στην ενδοκυτταρική αναλογία 2'-δεοξυουριδινο-5'-μονοφωσφορικής (dUMP)/θυμιδίνης-5'-μονοφωσφορικής (TMP) και (iii) την έκταση έκκρισης του 5-FdUMP και 5-FU από ανθρώπινα καλλιεργημένα κύτταρα με μεταφορείς ABC.Κάτω από τις πειραματικές μας συνθήκες, τα κύτταρα επωάστηκαν με 5-FU ή 5-FUrd.Στη συνέχεια, οι κυτταρικές πρωτεΐνες καταβυθίστηκαν με μεθανόλη.Αυτή η διαδικασία παρείχε υψηλή ανάκτηση εκχύλισης.Επιπλέον, για τη μέτρηση της έκκρισης 5-FU και 5-FdUMP από κύτταρα, πραγματοποιήσαμε ποσοτικοποίηση αυτών των μορίων σε μέσο καλλιέργειας.Τα μέσα είτε εγχύθηκαν απευθείας (5-FU) είτε υποβλήθηκαν σε εκχύλιση στερεάς φάσης χρησιμοποιώντας φυσίγγιο εκχύλισης Oasis Wax (5-FdUMP).Ο διαχωρισμός των αναλυτών πραγματοποιήθηκε σε στήλη dC18 Atlantis 3,5 μm, (100 mm × 2,1 mm id) με ισοκρατική λειτουργία χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό μυρμηκικού αμμωνίου/μεθανόλη/νερό (5/5/90, ν/ν) ως κινητή φάση.Ο χρόνος εκτέλεσης δεν ξεπέρασε τα 6,2 λεπτά.Οι αναλυόμενες ουσίες ιονίστηκαν σε διεπαφή ηλεκτροψεκασμού υπό τρόπο λειτουργίας αρνητικού ιόντος.Επικυρώσαμε τη μέθοδο σε ένα εύρος 2,5–150 ng mL-1 σύμφωνα με τις ενώσεις.Η μεταβλητότητα εντός και μεταξύ της ανάλυσης ήταν χαμηλότερη από 10% σε επτά ημέρες.Όλες οι ενώσεις ήταν σταθερές στα κύτταρα ή στο μέσο καλλιέργειας όταν τα δείγματα αποθηκεύτηκαν στους -20 °C για τουλάχιστον δύο εβδομάδες και μετά από τρεις κύκλους κατάψυξης-απόψυξης.Δεν παρατηρήθηκε επίδραση μήτρας και στα δύο μέσα.