Προϊόντα

Τα ευκαρυωτικά κύτταρα περιέχουν μια λεπτή ισορροπία λεπτών ποσοτήτων των τεσσάρων τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοσιδίων (dNTPs), επαρκείς μόνο για λίγα λεπτά αντιγραφής του DNA.Τόσο μια ανεπάρκεια όσο και ένα πλεόνασμα ενός μεμονωμένου dNTP μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένα ποσοστά μετάλλαξης, ελαττωματική επιδιόρθωση του DNA ή εξάντληση του μιτοχονδριακού DNA.Τα dNTP συνήθως ποσοτικοποιούνται με έναν ενζυματικό προσδιορισμό στον οποίο η ενσωμάτωση του ραδιενεργού dATP (ή του ραδιενεργού dTTP στον προσδιορισμό για dATP) σε συγκεκριμένα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια από μια DNA πολυμεράση είναι ανάλογη με τη συγκέντρωση του άγνωστου dNTP.Διαπιστώνουμε ότι η κοινώς χρησιμοποιούμενη πολυμεράση Klenow DNA μπορεί να υποκαταστήσει το αντίστοιχο ριβονουκλεοτίδιο για το άγνωστο dNTP οδηγώντας σε ορισμένες περιπτώσεις σε μεγάλη υπερεκτίμηση των dNTP.Τώρα περιγράφουμε τις συνθήκες ανάλυσης για κάθε dNTP που αποφεύγουν την ενσωμάτωση ριβονουκλεοτιδίου.Για τους προσδιορισμούς dTTP και dATP αρκεί να ελαχιστοποιηθούν οι συγκεντρώσεις του ενζύμου Klenow και του σημασμένου dATP (ή dTTP).για dCTP και dGTP έπρεπε να αντικαταστήσουμε το ένζυμο Klenow είτε με την Taq DNA πολυμεράση είτε με Thermo Sequenase.Προτείνουμε ότι σε ορισμένες προηγούμενες αναφορές η ενσωμάτωση ριβονουκλεοτιδίων μπορεί να έχει προκαλέσει πολύ υψηλές τιμές για dGTP και dCTP.