Προϊόντα

Ο τρόπος με τον οποίο τα αποτελέσματα ταυτόχρονων μεταλλάξεων συνδυάζονται για να αλλάξουν την ενζυματική δραστηριότητα δεν είναι εύκολα προβλέψιμος επειδή αυτά τα αποτελέσματα δεν είναι πάντα προσθετικά με γραμμικό τρόπο.Ως εκ τούτου, ο χαρακτηρισμός των επιδράσεων των ταυτόχρονων μεταλλάξεων των υπολειμμάτων αμινοξέων που δεσμεύουν το υπόστρωμα μπορεί να συμβάλει σημαντικά στην κατανόηση της εξειδίκευσης του υποστρώματος των ενζύμων.Στη βήτα-γλυκοσιδάση από το Spodoptera frugiperda (Sfbetagly), αμφότερα τα υπολείμματα Q39 και E451 αλληλεπιδρούν με το υπόστρωμα και αυτό είναι απαραίτητο για τον καθορισμό της εξειδίκευσης του υποστρώματος.Διπλοί μεταλλάκτες Sfbetagly (A451E39, S451E39 και S451N39) παρασκευάστηκαν με κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση, εκφράστηκαν σε βακτήρια και καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας χρωματογραφία συγγένειας.Αυτά τα ένζυμα χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας π-νιτροφαινυλ β-γαλακτοσίδη και ρ-νιτροφαινυλ βήτα-φουκοσίδη ως υποστρώματα.Η αναλογία k cat/Km για απλούς και διπλούς μεταλλάκτες του Sfbetagly που περιέχουν τοποκατευθυνόμενες μεταλλάξεις στις θέσεις Q39 και E451 χρησιμοποιήθηκε για να αποδειχθεί ότι η επίδραση στην ελεύθερη ενέργεια του ESdouble dagger (σύμπλεγμα ενζύμου-μετάβασης κατάστασης) των διπλών μεταλλάξεων (Gdouble daggerxy) δεν είναι το άθροισμα των επιπτώσεων που προκύπτουν από τις μεμονωμένες μεταλλάξεις (Gdouble daggerx και Gdouble daggery).Αυτή η διαφορά στο Gdouble dagger δείχνει ότι τα αποτελέσματα των μεμονωμένων μεταλλάξεων επικαλύπτονται εν μέρει.Ως εκ τούτου, αυτό το κοινό αποτέλεσμα μετράει μόνο μία φορά στο Gdouble daggerxy.Τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα για τις βήτα-γλυκοσιδάσες αποκαλύπτουν την παρουσία ενός δισχιδούς δεσμού υδρογόνου που περιλαμβάνει τα υπολείμματα Q39 και E451 και την ίδια υδροξυλομάδα του υποστρώματος.Επομένως, τόσο τα θερμοδυναμικά όσο και τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα υπολείμματα Q39 και E451 ασκούν αμοιβαία επίδραση στις αντίστοιχες αλληλεπιδράσεις τους με το υπόστρωμα.