Νέα

Το IPTG (ισοπροπυλ-β-D-θειογαλακτοσίδη) είναι ένα ανάλογο του υποστρώματος της β-γαλακτοσιδάσης, το οποίο είναι εξαιρετικά επαγώγιμο.Κάτω από την επαγωγή του IPTG, ο επαγωγέας μπορεί να σχηματίσει ένα σύμπλοκο με την πρωτεΐνη καταστολέα, έτσι ώστε η διαμόρφωση της πρωτεΐνης καταστολέα να αλλάξει, έτσι ώστε να μην μπορεί να συνδυαστεί με το γονίδιο στόχο και το γονίδιο στόχος να εκφραστεί αποτελεσματικά.Πώς πρέπει λοιπόν να προσδιορίζεται η συγκέντρωση του IPTG κατά τη διάρκεια του πειράματος;Είναι όσο μεγαλύτερο τόσο το καλύτερο;
Αρχικά, ας κατανοήσουμε την αρχή της επαγωγής IPTG: το οπερόνιο (στοιχείο) λακτόζης του E. coli περιέχει τρία δομικά γονίδια, τα Z,Y και A, τα οποία κωδικοποιούν τη β-γαλακτοσιδάση, την περμεάση και την ακετυλοτρανσφεράση, αντίστοιχα.Το lacZ υδρολύει τη λακτόζη σε γλυκόζη και γαλακτόζη ή σε αλλολακτόζη.Το lacY επιτρέπει στη λακτόζη στο περιβάλλον να περάσει από την κυτταρική μεμβράνη και να εισέλθει στο κύτταρο.Το lacA μεταφέρει την ακετυλομάδα από το ακετυλο-CoA στον β-γαλακτοσίδη, το οποίο συνεπάγεται την αφαίρεση της τοξικής επίδρασης.Επιπλέον, υπάρχει μια λειτουργική αλληλουχία Ο, μια αρχική αλληλουχία P και ένα ρυθμιστικό γονίδιο Ι. Ο κώδικας γονιδίου I είναι μια πρωτεΐνη καταστολέα που μπορεί να συνδεθεί στη θέση Ο της ακολουθίας χειριστή, έτσι ώστε το οπερόνιο (μετα) να καταστέλλεται και απενεργοποιημένο.Υπάρχει επίσης μια θέση δέσμευσης για θέση δέσμευσης πρωτεΐνης ενεργοποιητή καταβολικού γονιδίου-CAP ανάντη της αλληλουχίας έναρξης Ρ. Η αλληλουχία Ρ, η αλληλουχία Ο και η θέση δέσμευσης CAP μαζί αποτελούν τη ρυθμιστική περιοχή του οπερονίου lac.Τα κωδικοποιητικά γονίδια των τριών ενζύμων ρυθμίζονται από την ίδια ρυθμιστική περιοχή για να επιτευχθεί η συντονισμένη έκφραση των γονιδιακών προϊόντων.

Ελλείψει λακτόζης, το οπερόνιο λακ (μετα) βρίσκεται σε κατάσταση καταστολής.Αυτή τη στιγμή, ο καταστολέας lac που εκφράζεται από την αλληλουχία Ι υπό τον έλεγχο της αλληλουχίας προαγωγέα PI συνδέεται με την αλληλουχία Ο, η οποία εμποδίζει την RNA πολυμεράση να δεσμευτεί στην αλληλουχία Ρ και αναστέλλει την έναρξη της μεταγραφής.όταν υπάρχει λακτόζη, μπορεί να προκληθεί το οπερόνιο lac (μετα) Σε αυτό το σύστημα οπερονίου (μετα), ο πραγματικός επαγωγέας δεν είναι η ίδια η λακτόζη.Η λακτόζη εισέρχεται στο κύτταρο και καταλύεται από τη β-γαλακτοσιδάση για να μετατραπεί σε αλλολακτόζη.Το τελευταίο, ως επαγωγικό μόριο, συνδέεται με την πρωτεΐνη καταστολέα και αλλάζει τη διαμόρφωση της πρωτεΐνης, γεγονός που οδηγεί στη διάσπαση της πρωτεΐνης καταστολέα από την αλληλουχία Ο και στη μεταγραφή.Η ισοπροπυλθειογαλακτοσίδη (IPTG) έχει την ίδια δράση με την αλλολακτόζη.Είναι ένας πολύ ισχυρός επαγωγέας, ο οποίος δεν μεταβολίζεται από βακτήρια και είναι πολύ σταθερός, γι' αυτό χρησιμοποιείται ευρέως στα εργαστήρια.

Πώς να προσδιορίσετε τη βέλτιστη συγκέντρωση του IPTG;Πάρτε το E. coli ως παράδειγμα.
Το γενετικά τροποποιημένο στέλεχος E. coli BL21 που περιέχει το θετικό ανασυνδυασμένο pGEX (CGRP/msCT) εμβολιάστηκε σε υγρό μέσο LB που περιέχει 50μg·mL-1 Amp και καλλιεργήθηκε όλη τη νύχτα στους 37°C.Η παραπάνω καλλιέργεια εμβολιάστηκε σε 10 φιάλες φρέσκου υγρού μέσου LB των 50 mL που περιείχε 50 μg·mL-1 Amp σε αναλογία 1:100 για καλλιέργεια διαστολής και όταν η τιμή OD600 ήταν 0,6~0,8, προστέθηκε IPTG στην τελική συγκέντρωση.Είναι 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1.Μετά την επαγωγή στην ίδια θερμοκρασία και τον ίδιο χρόνο, λήφθηκε 1 mL του βακτηριακού διαλύματος και τα βακτηριακά κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE για να αναλυθεί η επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων IPTG στην έκφραση της πρωτεΐνης, και στη συνέχεια επιλέξτε τη συγκέντρωση IPTG με τη μεγαλύτερη έκφραση πρωτεΐνης.
Μετά από πειράματα, θα διαπιστωθεί ότι η συγκέντρωση του IPTG δεν είναι όσο το δυνατόν μεγαλύτερη.Αυτό συμβαίνει επειδή το IPTG έχει μια ορισμένη τοξικότητα στα βακτήρια.Η υπέρβαση της συγκέντρωσης θα σκοτώσει επίσης το κύτταρο.και γενικά μιλώντας, ελπίζουμε ότι όσο πιο διαλυτή πρωτεΐνη εκφράζεται στο κύτταρο, τόσο το καλύτερο, αλλά σε πολλές περιπτώσεις όταν η συγκέντρωση του IPTG είναι πολύ υψηλή, θα σχηματιστεί μεγάλη ποσότητα εγκλεισμού.Σώμα, αλλά η ποσότητα της διαλυτής πρωτεΐνης μειώθηκε.Επομένως, η καταλληλότερη συγκέντρωση IPTG συχνά δεν είναι όσο μεγαλύτερη τόσο το καλύτερο, αλλά όσο χαμηλότερη είναι η συγκέντρωση.
Ο σκοπός της επαγωγής και της καλλιέργειας γενετικά τροποποιημένων στελεχών είναι η αύξηση της απόδοσης της πρωτεΐνης στόχου και η μείωση του κόστους.Η έκφραση του γονιδίου στόχου δεν επηρεάζεται μόνο από τους ίδιους τους παράγοντες του στελέχους και το πλασμίδιο έκφρασης, αλλά και από άλλες εξωτερικές συνθήκες, όπως η συγκέντρωση του επαγωγέα, η θερμοκρασία επαγωγής και ο χρόνος επαγωγής.Επομένως, γενικά, πριν εκφραστεί και καθαριστεί μια άγνωστη πρωτεΐνη, είναι καλύτερο να μελετηθούν ο χρόνος επαγωγής, η θερμοκρασία και η συγκέντρωση IPTG προκειμένου να επιλεγούν οι κατάλληλες συνθήκες και να ληφθούν τα καλύτερα πειραματικά αποτελέσματα.