Προϊόντα

Νέα ανάλυση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης για γλυκοζυλοτρανσφεράσες που βασίζεται στην παραγωγοποίηση με ανθρανιλικό οξύ και ανίχνευση φθορισμού.

Αναπτύχθηκαν δοκιμές χρησιμοποιώντας τη μοναδική χημεία επισήμανσης του 2-αμινοβενζοϊκού οξέος (2ΑΑ, ανθρανιλικό οξύ, ΑΑ) για τη μέτρηση της δραστηριότητας τόσο της β1-4 γαλακτοζυλοτρανσφεράσης (GalT-1) όσο και της α2-6 σιαλυλτρανσφεράσης (ST-6) με υγρό υψηλής απόδοσης χρωματογραφία (HPLC) με ανίχνευση φθορισμού (Anumula KR. 2006. Advances in fluorescence παραγωγοποίηση μεθόδων για υψηλής απόδοσης υγρή χρωματογραφική ανάλυση γλυκοπρωτεϊνικών υδατανθράκων. Anal Biochem. 350:1-23).Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (GlcNAc) και Ν-ακετυλλακτοζαμίνη χρησιμοποιήθηκαν ως δέκτες και διφωσφορική ουριδίνη (UDP)-γαλακτόζη και μονοφωσφορική κυτιδίνη (CMP)-Ν-ακετυλνεουραμινικό οξύ (NANA) ως δότες για GalT-1 και ST-6, αντίστοιχα.Τα ενζυματικά προϊόντα επισημάνθηκαν in situ με ΑΑ και διαχωρίστηκαν από τα υποστρώματα στη στήλη TSKgel Amide 80 χρησιμοποιώντας συνθήκες κανονικής φάσης.Οι μονάδες ενζύμων προσδιορίστηκαν από τις περιοχές κορυφής σε σύγκριση με τα ταυτόχρονα παραγωγοποιημένα πρότυπα Gal-β1-4GlcNAc και NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Καθιερώθηκε η γραμμικότητα (χρόνος και συγκέντρωση ενζύμου), η ακρίβεια (ενδο-και ενδοδοκιμασία) και η αναπαραγωγιμότητα για τις δοκιμασίες.Οι δοκιμασίες βρέθηκαν να είναι χρήσιμες στην παρακολούθηση των ενζυμικών ενεργειών κατά την απομόνωση και τον καθαρισμό.Οι δοκιμασίες ήταν εξαιρετικά ευαίσθητες και πραγματοποιήθηκαν ίσες ή καλύτερες από τις παραδοσιακές μετρήσεις με βάση το ραδιενεργό σάκχαρο.Η μορφή της δοκιμασίας μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση της δραστικότητας άλλων τρανσφερασών, υπό την προϋπόθεση ότι οι δέκτες υδατανθράκων περιέχουν ένα αναγωγικό άκρο για επισήμανση.Αναπτύχθηκε ένας προσδιορισμός για αποδέκτες γλυκοπρωτεϊνών χρησιμοποιώντας IgG.Αναπτύχθηκε μια σύντομη μέθοδος προσδιορισμού προφίλ HPLC για τον διαχωρισμό των γλυκανών IgG (διεπαδικές G0, G1, G2, μονο- και δισιλυλιωμένες), η οποία διευκόλυνε τον προσδιορισμό των ενεργοτήτων GalT-1 και ST-6 με γρήγορο τρόπο.Επιπλέον, αυτή η μέθοδος προσδιορισμού προφίλ θα πρέπει να αποδειχθεί χρήσιμη για την παρακολούθηση των αλλαγών στις γλυκάνες IgG σε κλινικές συνθήκες.